Física Biológica PCLF/Microscopía

Microscopio de fuerza atómica, AFM

Desde su aparición en el año 1986 el microscopio de fuerza atómica o AFM por sus siglas en ingles, ha sido un instrumento importante para la investigación de la microestructura de los materiales. Este se basa en la interacción que se ejerce entre la punta y la superficie de la muestra. La punta esta ligada a una viga flexible o cantilever, la cual cuando ejerce contacto con la muestra hace que el cantilever se doble. Esta flexión se mide con un detector simultáneamente cuando se hace el barrido sobre la superficie de la muestra. El barrido puede consistir en mover la punta en distintas partes de la muestra o mover la muestra y dejar la punta fija. La deflexión del cantilever en cada punto se registra mediante la computadora y se genera un mapa del relieve de la muestra. El microscopio de fuerza atómica detecta la posición del cantilever con métodos ópticos, el cual consiste en usar un rayo láser que se refleja en la punta del cantilever y luego actúa sobre un fotodetector. El detector contiene particiones que permiten detectar cambios pequeños en la posición del haz incidente, incluso de unos pocos angstrom. Un diagrama del prototipo hablado se muestra en la figura 1.

Una vez que el AFM detecta la flexión del cantilever en cada punto se puede generar un mapa del relieve de la muestra. Las fuerzas que actúan sobre el cantilever son varias. Una de ellas es la fuerza de Van del Waals que ocurre entre átomos. Esta fuerza puede ser de atracción o de repulsión, dependiendo de la distancia entre los átomos. Esto da lugar a dos modos de operación, el modo con contacto y modo sin contacto. En el modo con contacto en la aplicación de la técnica AFM la punta mantiene un contacto físico suave con la muestra. La punta se une al final del cantilever con una baja constante de resorte, menor que la constante de resorte efectiva que mantienen los átomos de la muestra. Conforme la punta barre la superficie, la fuerza de contacto origina la flexión del cantilever de modo que éste se adapta a la superficie topográfica de la muestra. Como resultado, en el modo de AFM de contacto, la fuerza de van der Waals se equilibra con cualquier otra fuerza que intente mantener juntos a los átomos. Por tanto, cuando el cantilever empuja a la punta contra la muestra, este se flexiona forzando a los átomos de la punta-muestra a permanecer juntos.

La fuerza total que ejerce la punta sobre la muestra es la suma de las fuerzas de capilaridad y del cantilever, y debe equilibrar a la fuerza repulsiva de van der Waals. Para obtener una imagen gráfica de la superficie, se detecta la posición del cantilever, mediante el empleo de técnicas ópticas. Una radiación láser incide sobre el dorso especular del cantilever, y de ahí se refleje sobre un fotodetector sensible a la posición.

La relación entre la longitud del camino recorrido por la radiación láser entre el cantilever y el detector, y la longitud propia del cantilever origina una amplificación mecánica. Como resultado el sistema puede detectar movimientos verticales de la punta del cantilever inferiores a los amstrong. Además el AFM en modo contacto, puede trabajar en modo de fuerza constante o modo de altura constante. El modo de altura constante consiste en medir directamente la deflexión a medida que el cantilever hace el barrido superficial. La imagen se genera con los datos de coordenadas x-y del barrido más el valor z de la deflexión del cantilever. En el modo de fuerza constante usa un lazo de control automático para mantener la flexión constante, esto se logra con un circuito de retroalimentación que mueve el escáner en la dirección z, es decir hacia arriba o hacia abajo de acuerdo a la topografía del material. En este caso la imagen se genera con las coordenadas x-y del barrido mas la señal z de la altura de la sonda. En este modo la velocidad de escaneado esta limitada por el tiempo de respuesta del circuito de retroalimentación, y la fuerza ejercida sobre la muestra por la punta es constante y bien controlada. Generalmente se prefiere esta modalidad para la mayoría de las aplicaciones. El modo de altura constante se suele usar para tomar imágenes de escala atómica de superficies extremadamente planas, en las cuales se generan pequeñas deflexiones del cantilever. Dado que este modo es más rápido permite a veces estudiar fenómenos en tiempo real en los que la superficie sufre cambios rápidos.

En el modo sin contacto se excita el cantilever cerca de su frecuencia de resonancia, de modo que vibre cerca de la superficie de la muestra, a una cierta distancia. La técnica NC-AFM se utiliza cuando no se quiere deteriorar la superficie a medir. La fuerza que se ejerce en la punta sobre la muestra es muy baja. Además La sensibilidad de la técnica proviene de la frecuencia de resonancia del cantilever, por tanto conforme se acerca la punta a la superficie se detectan cambios en la frecuencia de resonancia o en la amplitud, con una resolución vertical por debajo de los anstromg. Los dos modos de operación en el microscopio de fuerza atómica se ven reflejados en la figura 1, donde se percibe como se ejerce la interacción entre la punta y la superficie de la muestra.

Análisis matemático

La ecuación de movimiento del cantilever se provee como:

$m{\frac {d^{2}z}{dt^{2}}}=F_{drive}-kz+F_{ext}+2\gamma {\frac {dz}{dt}}$

donde $F_{ext}$es la fuerza del sistema subamortiguado y es despreciable ante la fuerza de arrastre $F_{drive}$.

Además $F_{drive}$ es el forzamiento interpuesto por el piezoeléctrico y esta dado por:

$F_{drive}=kA_{d}\cos {\omega _{0}t}$

Considerando las vibraciones de un sistema masa-resorte cuando se aplica una fuerza externa (ver figura), en nuestro caso un forzamiento periódico, donde k y m, son constante elastica y la masa del cantilever, respectivamente, se concibe necesario hacer un estudio al efecto de una función del forzamiento cosenoidal sobre el sistema regido por una ecuación diferencial.

${\frac {d^{2}z}{dt^{2}}}+(\omega _{0})^{2}z+b{\frac {dz}{dt}}=F_{drive}/m$

donde $b={\frac {2\gamma }{m}}$

Una solución se da de la forma $z=z_{h}+z_{p}$ donde $z_{h}$ es la solución general de la ecuación homogénea y $z_{p}$ es una solución particular; En el caso nuestro no se habla de sistema estacionario, por ende se tiene:

$z=A\cos(\omega _{0}t+\delta )+z_{h}$

La solución general de la ecuación homogénea, se concibe considerando el movimiento de un sistema regido por la ecuación:

${\frac {d^{2}z}{dt^{2}}}+(\omega _{0})^{2}z+b{\frac {dz}{dt}}=0$

Además z es igual a:

$z=A_{1}\exp(i\varpi {t)}\Rightarrow {\varpi \epsilon \subset }$

Reemplazando z, z' y z'' en la ecuación diferencial tenemos:

$-\varpi ^{2}A_{1}\exp {i\varpi {t}}+ib\varpi {A_{1}\exp {i\varpi {t}}}+(\omega _{0})^{2}A_{1}\exp {i\varpi {t}}=0$

La ecuación auxiliar asociada con la ecuación anterior es:

$-\varpi ^{2}+ib\varpi +(\omega _{0})^{2}=0$

Además las raíces son:

$\varpi ={\frac {ib\pm {\sqrt {4(\omega _{0})^{2}-b^{2}}}}{2}}$

Por consiguiente la solucion general de la ecuación homogénea es:

$z=A_{1}\exp {\frac {-bt}{2}}\sin {{\frac {\sqrt {4(\omega _{0})^{2}-b^{2}}}{2}}t}$

Estabilidad en un AFM

Utilizando el teorema de Virial

$\langle k\rangle =-{\frac {1}{2}}\langle F\cdot Z\rangle |$

y el hecho de que la energia al tener un comportamiento periodico su valor medio debe ser nulo, por lo que se debe verificar que

$\langle {\frac {dE}{dt}}\rangle =0$

.

ahora bien sabemos del sistema su ecuaci\'on de movimiento, la cual esta dada por

$m{\frac {d^{2}z}{dt^{2}}}=-kz-{\frac {mw_{0}}{Q}}{\frac {dz}{dt}}+F_{ts}+F_{0}cos{(wt)}$

,

donde sabemos que $Q|$, $k|$ y $w_{0}|$ son el factor de calidad, constante del resorte y frecuencia de resonancia angular del cantilever libre, respectivamente. $F_{0}$ y $w$ son la amplitud y la frecuencia angular de la fuerza impulsora. entonces para tal ecuacion de movimiento se propone una solucion del siguiente tipo

$z(z_{c},t)=z_{0}(z_{c})+A(z_{c})cos{(wt-\theta (z_{c}))}|$

donde $z_{0}$,$A$, y $\theta$ son los valores medios de deflexion, amplitud, y cambio de fase de la oscilación Ahora bien pretendemos encontrar una relacion entre la amplitud, la fase y la interaccion punta-superficie.

con lo que debemos tener en cuenta que la energia total del sistema esta dada por la combinacion entre los aportes de energia cinetica (la cual como vimos de la ecuación (1) que su magnitud es lamitad de la energia potencial) y potencial teniendo asi que

$E=k+F\cdot z$

entonces

$E={\frac {1}{2}}{F\cdot z}$

,

donde el valor de $F$ que es la fuerza neta es conocida por la ecuacion (3)puesto que la segunda ley de Newton nos dice que $F=m{\frac {d^{2}z}{dt^{2}}}$ y ademas de esto es conocido el valor de $z$ pues es la solucion propuesta en la ecuacion (4). ahora bien haciendo efectivo el producto tenemos que

$F\cdot z=-kz^{2}-{\frac {mw_{0}}{Q}}{\frac {dz}{dt}}z+F_{ts}z+zF_{0}cos{(wt)}$

tratando un poco los terminos por separado de la ecuacion (7) podemos decir de cada uno de ellos que

${\frac {dz}{dt}}z=z_{0}Awsin{(wt-\theta )}+{\frac {1}{2}}A^{2}wsin{2(wt-\theta )}$

tambien tenemos que

$z^{2}=z_{0}^{2}+2Az_{0}cos{(wt-\theta )}+A^{2}cos^{2}{(wt-\theta )}$

y tambien tenemos que

${\frac {dz}{dt}}=-Awsin{(wt-\theta )}|$

remplazando en la ecuacion (7) teniendo en cuenta que este es el termino correspondiente a dos veces la energia como se puede ver de la ecuaci\'on (6) podemos llegar ala siguiente expresion para la energia

$2E(t)=AF_{0}cos{(wt)}cos{(wt-\theta )}+z_{0}F_{0}cos{(wt)}-2kz_{0}Acos{(wt-\theta )}-kA^{2}cos^{2}{(wt-\theta )}|$

$+{\frac {mw_{0}Aw}{Q}}sin{(wt-\theta )}+{\frac {mw_{0}A^{2}w}{2Q}}sin{2(wt-\theta )}-kz_{0}+F_{ts}\cdot z|$

Mas sinembargo la condicion fundamental que tenemos es la dada por la ecuacion (2) donde la diferenciacion de la energia ya se puede realizar debido a que ya se definio funcionalmente la energia, por tanto tenemos que de una manera bonita esta expresion quedad expresada como

$2{\frac {dE}{dt}}=-AF_{0}wsin(\theta )+A^{2}w_{0}^{2}mw[sin[(wt-\theta )]+{\frac {w}{w_{0}Q}}cos{2(wt-\theta )}]|$

$+w_{0}^{2}z_{0}mwA[2sin{(wt-\theta )}+{\frac {w}{w_{0}Q}}cos{(wt-\theta )}]-z_{0}F_{0}sin(wt)+F_{ts}\cdot {\frac {dz}{dt}}|$

ahra, teniendo la expresion funcional de la variacion de la energia en el tiempo entonces bastaria hallar su valor medio, donde es importante saber que el valor medio es definido como

$\langle {2{\frac {dE}{dt}}}\rangle ={\frac {1}{T}}\int _{0}^{T}{\frac {dE}{dt}}dt|$

se debe recordar que el valor medio de cualquier funcion seno o coseno sin importar el argumento que esta posea esta dado por ${\frac {1}{2^{\frac {1}{2}}}}$ claro esta tomando como amplitud de la funcion periodica la unidad, por tanto tenemos que el valor medio de la derivada de la energia con respecto al tiempo queda expresado asi

$\langle {2{\frac {dE}{dt}}}\rangle ={\frac {z_{0}F_{0}}{2^{\frac {1}{2}}}}-AF_{0}wsin(\theta )|$

$+{\frac {Akw}{2^{\frac {1}{2}}}}[{\frac {Aw+Aw_{0}Q+2z_{0}w_{0}^{2}Q+z_{0}w_{0}w}{w_{0}Q}}]+\langle {F_{ts}\cdot {\frac {dz}{dt}}}\rangle |$

luego tomando mi referencia tal que $z_{0}=0$ se tiene la siguiente expresion

$\langle {\frac {dE}{dt}}\rangle =-{\frac {AF_{0}w}{2}}sin(\theta )+{\frac {A^{2}w^{2}k}{2^{\frac {1}{2}}w_{0}Q}}+\langle F_{ts}\cdot {\frac {dz}{dt}}\rangle +{\frac {A^{2}kw}{22^{\frac {1}{2}}}}|$

mas sin embargo profe el resultado al que deberia llegar deberia ser el dado por la siguiente expresion

${\frac {-AF_{0}w}{2}}sin(\theta )+{\frac {A^{2}w^{2}k}{2Qw_{0}}}+\langle F_{ts}\cdot {\frac {dz}{dt}}\rangle =0|$

bueno profe finalmente me gustaria que usted me diera su opinion acerca de lo hecho, pues quisiera saber si mi rasocinio es el correcto , aunque algo tuvo que pasar pues el error como nos podemos dar cuenta es debido a un solo termino, profe le mando estos resultados porque estoy realmente interesado en aprender y como usted me lo dijo alguna vez, aprender pero teniendo en cuenta los fundamentos y las hipotesis con las que yo realizo los analisis fisicos. pues considero que el desarrollo de esta expresion junto con la fisica que se pueda sacar del respectivo desarrollo dan pie a una analisis fenomenologico bastante completo como se vio en el articulo que trabajamos en el curso.

MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES

El microscopio de contraste de fases me permite observar efectos dinámicos de muestras biológicas vivas, dada la interferencia generada en los rayos de luz que atraviesan la muestra. Cabe anotar que estas muestras deben ser transparentes.

La figura presentada es el prototipo funcional del microscopio estudiado; en ella se indica las componentes principales del montaje, donde además se muestra dos rayos de luz 1 y 2 y su interacción con la muestra; el rayo 1 atraviesa la muestra. Este se va ha diferenciar de 2 en amplitud y fase después de haber atravesado la muestra, como se indica en la siguiente gráfica.

También encontramos el anillo para evitar la distorsión, estó dado a que queremos qué la luz incidente sobre la muestra sea el tipo de onda plana. Además el anillo, está en la capacidad de hacer que la luz incida sobre la muestra en caso de que tenga algún tipo de movimiento. Al tener clara lo mencinado, podemos distinguir dos zonas espaciales con luz de diferente amplitud y fase, a partir de un plano que he se a llamado cero en donde esta ubicada la muestra. La figura siguiente nos muestra estas dos zonas. Una es de color azul y allí estoy viendo la luz que atraviesa la muestra. Una vista espacial nos mostraría un cono, la zona que he puesto en naranja contiene la luz que no toca la muestra por lo que está no se ve afectada, ni su amplitud, y tampoco su fase.

Ahora bien, lo que resta es obtener la imagen que nos genera la interferencia en la zona azul, para lo cual solo tenemos que enfocar todos estos rayos a una pantalla, mediante un conjunto de lentes similar al de un microscopio convencional cuyo funcionamiento básico es el ilustrado en la siguiente figura.

Como se dijo inicialmente este microscopio nos permite observar efectos dinámicos, se utiliza en microbiología para estudiar hongos, bacterias, organismos unicelulares, entre otros. Dada las condiciones de la muestra y su excitación al percibir luz es aconsejable ubicar la lámpara en la parte baja. Para el caso de las proteínas se les adhiere un material fluorescente para que su emisión de luz sea perceptible.